蚯蚓蛋白粗提物的提取工艺和酶活测试

2018/10/16 来源:生物探索
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导读
我国使用动物类药材历史悠久,与其他药物相比,动物药具有功能广泛、药效显著等特点。中药地龙是一种常用动物药材,具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效,药理活性显著,资源丰富。应用现代分离手段从蚯蚓蛋白粗提物中分离到多组具有纤溶酶活性的蛋白质,并

我国使用动物类药材历史悠久,与其他药物相比,动物药具有功能广泛、药效显著等特点。中药地龙是一种常用动物药材,具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效,药理活性显著,资源丰富。应用现代分离手段从蚯蚓蛋白粗提物中分离到多组具有纤溶酶活性的蛋白质,并首次命名为“蚓激酶”。进行蚓激酶化合物酶活测试,有利于蚓激酶的活性研究,优化其提取工艺。

随着分子生物学技术以及分析技术迅速发展, DNA分析、凝胶电泳、毛细管电泳等分析方法以及生物活性检查等用于蚓激酶化合物酶活测试,为中药动物药蚓激酶的质量控制提供了新的手段。美迪西提供化合物酶活测试服务,其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验,通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等,提供一套完整的生物学服务。

1、蚓激酶的提取工艺

蚓激酶的分离纯化技术目前比较成熟,常用的分离步骤是:制备蚯蚓匀浆→盐析→凝胶层析→离子交换层析→HPLC 或FPLC纯化。在中药制剂中,地龙常有以下处理方法:以干燥体经粉碎后直接入药、采用水或乙醇提取后入药、或以鲜品为原料经匀浆提取并冷冻干燥后入药,对于以溶栓为主要作用的中药制剂,其工艺以后者为佳。

蚓激酶提取工艺的研究通常蚓激酶的提取方法是盐析,继而用多种层析及HPLC、FPLC乃至亲和层析、或离子交换、分子筛、凝胶电泳等手段从不同品系的蚯蚓中获得多种纤溶酶单纯组分,但操作麻烦,流程长,且酶活力损失很大,又不适合工业化生产。考虑到蚓激酶是多种有活性组分组成,所以,在提取时采用更适合工业化生产的工艺,选择具有生物活性蛋白的分子量区间进行分离。

取一定量的活蚯蚓,水洗数次,尽最大可能使其内脏中的污物排出,然后捞出用滤纸尽量吸其多余水分,称重,加2倍体积的缓冲液于匀浆器中匀浆5分钟,在4摄氏度冰箱中静置4小时后,高速离心,弃去沉淀,取上上清液加固体硫酸铵达到一定饱和度,以4000r/min离心10min。收集上清液,然后加入固体硫酸铵,以获得更高的饱和度。静置过夜,高速离心,收集沉淀,然后用缓冲溶液溶解沉淀物,用透析袋透析去盐或用超滤方法浓缩后,用冷冻干燥剂冻干。这是一种淡褐色粉末状物质,它是蚯蚓激酶的粗产物。

2、蚓激酶化合物酶活测试方法

(1)铺板

取琼脂糖溶液16.2ml,纤维蛋白原液16.2ml,凝血酶液1.3ml混匀,倒入直径225px的有机玻璃盘上,室温放置半小时,即成。

(2)标准品溶液的配制

取尿激酶标准品,用0.9%氯化钠溶液配成每1ml中含100u、80u、60u、40u、20u五个浓度。

(3)样品溶液的配制

取样品适量,用0.9%氯化钠溶液配成标准曲线范围内的浓度。

(4)测定方法

用微量注射器,分别吸取尿激酶标准品溶液及样品溶液10ml,滴在同一平板上,加盖,并在37摄氏度温育18小时,取出后用卡尺测量溶圈垂直两直径,以两直径乘积为纵坐标,尿激酶标准品为横坐标,在双对数纸上绘制标准曲线,供试品溶圈垂直两直径乘积,在尿激酶标准曲线图上查得活力单位,计算样品效价单位数。

目前我国很多科研机构正在研发蚯激酶,如果可以提高其生产率,并保持活性,这对于治疗血栓类疾病以及促进我国医药工业的发展具有重要的作用。随着蚓激酶活性的发现,含地龙中药的工艺及质量控制研究都已经取得一定进展,出现了一些可喜的变化。

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