CRISPR/Cas9降低脱靶效应的最新进展

2014/02/06 13:33

CRISPR/Cas9是由DNA切割酶Cas9和一段与靶 DNA片段匹配的20个核苷酸长度的导向RNA(gRNA)片段构成。由于其构建简单方便,成功率高,可以实现多基因敲除,而且有可能直接得到纯合子突变体,因此得到众多科研人员的青睐。尽管最初报道CRISPR/Cas9系统具有很高的特异性,研究者宣称即便是一个核苷酸的错配都可以阻止CRISPR-Cas9继续发挥作用,但是麻省总医院的研究人员却发现,在人类细胞系中,多达5个核苷酸的错配都未必阻止目标位点外的切割(High-frequencyoff-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells, NatureBiotechnology, 2013 Sept; 31:822-6)。他们还发现,脱靶位点的突变率与目标位点的突变率相同甚至更高,而这种现象未见于ZFN和TALEN技术。显然CRISPR/Cas9的脱靶问题将会严重限制其应用。


为了减弱甚至消除脱靶效应,科学家进行了不同的尝试。哈佛医学院的George Church研究小组制备了一系列的Cas9突变体(nickases),这些Cas9突变体不能使DNA双链断裂,而只是引入了偏移缺口,每个缺口只影响一条DNA链,这样它通常不会导致非同源末端连接(NHEJ)引起的插入或删除。因此,这种方法可能会减少脱靶效应 (Cas9 transcriptional activators for targetspecificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,Nature Biotechnology, 2013, Sept; 31: 833-8)。由于CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处10-12bp碱基的配对,而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识别影响不大。麻省总医院的J.KeithJoung研究组系统研究了去除远端碱基对gRNA结合靶点的影响,他们发现含17或18个碱基的gRNA具有与全长的gRNA相同的(甚至更高的)靶点结合能力,而长度为15或16碱基的gRNA与靶点的结合力则大大降低甚至丧失。更进一步的研究显示含17个碱基的truncated CRISPR/Cas9可以往人细胞系的靶点有效的导入突变,而脱靶效率则大大降低,有些位点的脱靶效率降低高达5000倍。这一研究发表于2014年1月26日的Nature Biotechnology上 (ImprovingCRISPR/Cas Nuclease specificity using truncated guide RNAs, Nature Biotechnology, 2014, Jan. 26)。而且truncatedgRNA与Nickases结合可以更进一步降低脱靶。

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